1、取一15ml离心管，加入2ml已用抗凝剂处理过的人血液样品，再加入等体积的PBS进行稀释（终体积4ml）。

  注：若为经过处理的浓缩血液样品，请按照新的稀释倍数合理稀释。为了保证分离细胞的活力和效率，请使用新鲜血液，血液样品请于18-20℃保存。

  2、上下颠倒或用枪混匀样品，备用。

  3、上下翻转确保Ficoll-Paque PLUS（GE）分离液彻底混匀，去掉聚丙烯瓶盖，使用注射器针头插入瓶塞吸取3ml分离液。

  注: 分离之前请将Ficoll-Paque PLUS分离液预热至18-20°C。

  4、取一新的无菌15ml离心管，加入3ml步聚3中取出的分离液。

  5、小心加入稀释好的4ml血液样品，不要打破Ficoll-Paque PLUS液面。

  注: 可将离心管倾斜至与水平台面呈30°，缓慢沿管壁加入血液样品。

  6、将离心管小心竖直放入离心机内，于18-20°C，400g离心30-40 min。

  注：特别注意将离心机的降速加速度调到0。

  7、小心取出离心管。此时液体分为3层，中层为分离液层，最下层为红细胞，最上层为血浆。位于中层靠近血浆层的白膜层即为单个核细胞层，小心吸走血浆层，不要打动白膜层。

  注：可吸出最上层的血浆层保存以备后续使用。

  8、用无菌移液枪将白膜吸到一新的离心管中。

  9、用三倍体积（约6ml）的无菌PBS重悬步骤7中的PBMC，重悬时用枪轻柔吹散，于18-20°C，400g离心10-15min，重复一次，最后用培养基重悬备用，多余的PBMC可以冻存继续使用。

  特注：在较高的离心速度下（400-500g）可以提高PBMC的得率，同时需注意在较低的离心速度下（60-100g）可以分离掉不需要的血小板。另外如上操作和比例适用于更大体积的分离。

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